冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實(shí)驗(yàn)操作步驟：  
a．采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。    
b．立即在無菌超凈臺(tái)內(nèi)用70％乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。  
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。   
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。   
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

實(shí)驗(yàn)材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml滅菌燒杯2個(gè)； 
3、50ml離心筒2個(gè) 
4、滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè) 
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個(gè)；無菌玻璃攪拌棒1個(gè) 
6、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1塊； 
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 
8、酒精燈1臺(tái)；
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：
1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞
在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控、檢測(cè)甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行人為的控制，同時(shí)，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。
3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性
通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時(shí)，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。
4.研究?jī)?nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄
采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備 
記錄方式可采用攝影照片、縮時(shí)電影、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛
應(yīng)用的學(xué)科領(lǐng)域較為寬廣，如細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等；
適用的對(duì)象范圍廣，從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物，一種動(dòng)物的不同年齡階段以及不同組織，都可進(jìn)行有針對(duì)性的研究。
6.研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì)
可提供大量、同一時(shí)期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

細(xì)胞凍存：
對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行凍存的最佳方法是將細(xì)胞置于含有(DMSO)等冷凍保護(hù)劑的*培養(yǎng)基中于液氮中儲(chǔ)存。冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的冰點(diǎn)，并可減緩冷卻速度嗎，大大降低冰晶形成的危險(xiǎn)  (冰晶可損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡)。
注：DMSO 可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。操作含DMSO的試劑時(shí)，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。 
細(xì)胞凍存指導(dǎo)原則
凍存細(xì)胞系以備將來之用時(shí)，必須遵守以下原則。與其他細(xì)胞培養(yǎng)操作一樣，我們建議您嚴(yán)格遵守您所用細(xì)胞系附帶的操作說明，以便獲得最佳結(jié)果。 
1）在高細(xì)胞濃度情況下進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的凍存，并且細(xì)胞傳代次數(shù)盡可能少。確保凍存前活細(xì)胞百分比至少為90%。請(qǐng)注意最佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。 
2）細(xì)胞應(yīng)緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器使溫度每分鐘大約降低1°C。
3）必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護(hù)劑
4）將冷凍的細(xì)胞于 -70°C 以下溫度儲(chǔ)存；溫度高于 -50°C 時(shí)，冷凍的細(xì)胞將開始變質(zhì)。 
5）必須使用無菌凍存管儲(chǔ)存冷凍的細(xì)胞。裝有冷凍細(xì)胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存 
6）必須穿戴個(gè)人防護(hù)設(shè)備。 
7）所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。
ADORA2B 腺苷A2b受體/神經(jīng)生長(zhǎng)因子1受體抗體
ALS2CR1 肌側(cè)索硬化癥相關(guān)蛋白1抗體
APBA2 β淀粉樣前體蛋白結(jié)合蛋白2抗體（X11β）
Diazepam Binding Inhibitor 乙酰輔酶A結(jié)合蛋白抗體
phospho-CDC16(Ser560) 磷酸化細(xì)胞分裂周期蛋白16抗體
AHI1 白血病相關(guān)蛋白AHI1抗體
AICDA 活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶抗體
ABCA9 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9抗體
ARF3 ADP核糖基化因子3抗體
AARSD1 含丙氨酰tRNA合成酶結(jié)構(gòu)域1抗體
AMIGO1 粘附分子IgG樣結(jié)構(gòu)域蛋白1抗體
KAL1 卡爾曼綜合癥基因1抗體
ASB7 含錨蛋白重復(fù)序列-細(xì)胞因子信號(hào)抑制物盒蛋白家族7抗體
ASB17 含錨蛋白重復(fù)序列-細(xì)胞因子信號(hào)抑制物盒蛋白家族17抗體
ASB12 含錨蛋白重復(fù)序列-細(xì)胞因子信號(hào)抑制物盒蛋白家族12抗體
ATPase Na+/ K+ beta 2 鈉鉀ATP酶通道蛋白抗體
AGXT2L2 AGXT2L2蛋白抗體
ANKS1B β淀粉樣蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白1抗體
ANKS6 錨蛋白重復(fù)及SAM結(jié)構(gòu)域蛋白6抗體
ART3 二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶3抗體
ART5 二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶5抗體
AMPD1 腺苷單磷酸脫氨酶1抗體
Ankyrin erythroid 紅細(xì)胞蛋白Ank1抗體
Adenylosuccinate Lyase 腺苷酸琥珀酸裂解酶抗體
A1BG α1B糖蛋白抗體
A1CF 載脂蛋白B-mRNA編碼蛋白抗體
AIFM3 凋亡誘導(dǎo)因子3抗體
Apaf1 Interacting Protein 凋亡蛋白活性因子1相互作用蛋白抗體
APPD 凋亡誘導(dǎo)蛋白D抗體
Acid sphingomyelinase 酸性神經(jīng)鞘磷脂酶抗體
ANT-1 腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抗體
ALS2CR8 肌側(cè)索硬化2染色體區(qū)域候選蛋白8抗體
ATP6IP2 ATP酶H+轉(zhuǎn)運(yùn)溶酶體輔助蛋白2抗體
Azurocidin 肝素結(jié)合蛋白/陽離子抗菌蛋白37/天青殺素抗體
Alpha-Synuclein 核突觸蛋白抗體
beta-Actin (Loading Control) β-肌動(dòng)蛋白/β-Actin 抗體（內(nèi)參抗體）
beta-Amyloid 1-42 (CT) β淀粉樣肽1-42(C端)/β-Amyloid 1-42 (CT)抗體
beta Amyloid 1-16 β淀粉樣肽1-16/Aβ1-16抗體
beta Amyloid 1-28 β淀粉樣肽1-28/β-Amyloid 1-28抗體
ARIP2a 激活素受體2A抗體
Aquaporin 5 水通道蛋白5抗體
beta Amyloid 1-40 β淀粉樣肽（1-40）抗體
beta Amyloid 1-42 β淀粉樣肽（1-42）抗體
APOA1 載脂蛋白A1抗體
Beta-arrestin 1 β-抑制蛋白1抗體
小鼠載脂蛋白B100(Apo B100)ELISA試劑盒 ，英文名： Apo B100 ELISA Kit
小鼠載脂蛋白B(ApoB)ELISA試劑盒 ，英文名： ApoB ELISA Kit
小鼠載脂蛋白A5(apo-A5)ELISA試劑盒 ，英文名： apo-A5 ELISA Kit
小鼠載脂蛋白A1(apo-A1)ELISA試劑盒 ，英文名： apo-A1 ELISA Kit
小鼠載脂蛋白A1(Apo A1)ELISA試劑盒 ，英文名： Apo A1 ELISA Kit
小鼠孕酮受體(PROGR)ELISA試劑盒 ，英文名： PROGR ELISA Kit
小鼠孕酮(PROG)ELISA試劑盒 ，英文名： PROG ELISA Kit
小鼠孕激素/孕酮(PROG)ELISA試劑盒 ，英文名： PROG ELISA Kit
小鼠誘導(dǎo)型一氧化合成酶(iNOS)ELISA試劑盒 ，英文名： iNOS ELISA Kit
小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)ELISA試劑盒 ，英文名： iNOS ELISA Kit
小鼠游離脂肪酸(FFA)ELISA試劑盒 ，英文名： FFA ELISA Kit
小鼠游離三碘甲狀腺原氨酸(Free-T3)ELISA試劑盒 ，英文名： Free-T3 ELISA Kit
小鼠游離甲狀腺素(FT4)ELISA試劑盒 ，英文名： FT4 ELISA Kit
小鼠游離睪酮(F-TESTO)ELISA試劑盒 ，英文名： F-TESTO ELISA Kit
小鼠幽門螺旋菌IgG(Hp-IgG)ELISA試劑盒 ，英文名： Hp-IgG ELISA Kit
小鼠印度刺猬因子(IHH)ELISA試劑盒 ，英文名： IHH ELISA Kit
大鼠肝星形細(xì)胞小鼠吲哚胺2,3-雙加氧酶1(IDO1)ELISA試劑盒 ，英文名： IDO1 ELISA Kit
小鼠音猬因子N端(Shh-N)ELISA試劑盒 ，英文名： Shh-N ELISA Kit
實(shí)驗(yàn)操作：
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗(yàn)前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺(tái)吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%麻醉，75%酒精浸泡，無菌條件下迅速取出大鼠主動(dòng)脈。
3、材料預(yù)處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復(fù)洗滌，去除血管外部的洗滌液澄清，用無菌鑷子剝?nèi)ネ饽っ娴臍埩艚M織。PBS洗滌凈。
4、除去內(nèi)皮細(xì)胞：將血管縱向剪開， 內(nèi)膜面向上，無菌鑷子沿中軸方向反復(fù)刮動(dòng)內(nèi)膜層4-5遍，去掉內(nèi)皮細(xì)胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次。
5、分離中膜：將去掉內(nèi)膜的血管，繼續(xù)刮動(dòng)分離中膜，去掉外膜，用眼科剪將內(nèi)膜剪碎為1×1mm3的小塊，加入1 × PBS （pH 7.4 ），轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，PBS洗滌3次，離心收集沉淀物。
6、消化：在洗凈的內(nèi)膜碎塊中加入消化酶液，將離心管放入37℃水浴消化15min。
7、終止消化：吸出消化液入新的離心管中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)；余下的組織繼續(xù)加入消化液，消化15min ，重復(fù)消化3次。
8、收集重懸細(xì)胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。
9、培養(yǎng)細(xì)胞密度：調(diào)整細(xì)胞密度以5 × 105個(gè)/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
10、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。